文章题目：Constructing a Tandem Mass Spectral Library for Forensic Ricin Identification
构建用于鉴定蓖麻毒素的串联质谱库
解读人：马臻
Doi号：https://doi.org/10.1021/acs.jproteome.9b00377
文章链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jproteome.9b00377
文章的实验室和主要参与人员:
实验室：美国西北太平洋国家实验室化学与生物科学小组
参与人员：Isabelle O’Bryon、Abigail E. Tucker、Brooke L. D. Kaiser、Karen L. Wahl
摘要介绍：
蓖麻毒素是一种在蓖麻籽中发现的蛋白质，是一种致命毒素，蓖麻毒蛋白中毒的案例相对普遍。许多检测蛋白质毒素的方法（例如蓖麻毒素）都使用靶向液相色谱-串联质谱（LC-MS / MS）来鉴定毒素肽，通常是胰蛋白酶肽。但是，在法医学实践中，使用非目标蛋白质组学方法（包括数据库搜索）进行肽和蛋白质鉴定并不常见，而且对于法医学工作者来说可能并不熟悉。在这里，研究者提出了一种创建胰蛋白酶蓖麻毒素肽谱库的方法，并通过谱库搜索将这些库用于蓖麻毒素鉴定。由于质谱库在小分子鉴定中的使用，对于法医科学家可能更熟悉。肽谱库可以直接与真实标准进行比较，而真实标准是司法分析的关键要素，但以前从未在司法环境中使用过。为了构建这些质谱库，用胰蛋白酶消化了两个纯蓖麻毒蛋白样品（一个来自建议的标准参考物质），并使用标准shot弹枪LC-MS / MS协议进行了分析。用四个数据库搜索工具结果中的所得胰蛋白酶肽创建质谱库。然后将该库用于使用SpectraST进行法医学鉴定的蓖麻籽提取物的搜索。这些蓖麻籽样品是使用现实蓖麻毒素病例中常见的粗制方法制得的。分析表明，与MS-GF +和Sequest plus Percolator数据库搜索相比，质谱库搜索可从粗蓖麻籽样品中鉴定出更多肽。这些结果是质谱库搜索首次用于检测法医相关样品中蛋白质毒素的结果。数据可通过ProteomeXchange获得，标识符为PXD013711。
关键词：法医蛋白质组学，质谱，质谱库，蓖麻毒素，毒素
背景介绍：
蓖麻毒素是在蓖麻种子中产生的一种毒素，该种子在许多地区是常见的观赏植物或野生植物，并且还可以商业化种植以生产蓖麻油。 蓖麻毒素最多吸入时具有致死性，在小鼠中的LD50为3-5μg/ kg1。 它与细胞表面膜结合，并且一旦被内在化，就会通过使核糖体RNA上的特定位点脱嘌呤而迅速使核糖体失活。 该蛋白质是一种异二聚体，由两条链组成，一条链A使28S rRNA失活，一条链B与细胞摄取有关。 吸入，摄入或注射蓖麻毒蛋白后，全身的核糖体将不再继续产生蛋白质，从而导致细胞死亡。 尚未开发解毒剂。 因此，在各种情况下都需要检测蓖麻毒蛋白的方法。
质谱方法，尤其是非靶向蛋白质组学方法，与基于免疫和酶活性的方法相比，具有某些优势。非靶向蛋白质组学方法的另一个优点是可以进行一个分析工作流程只需更改搜索的数据库或谱库，即可将其应用于多种蛋白质靶标。法医化学所有领域中的许多方法都依赖于与已知标准的比较确定化合物。传统蛋白质组学数据库搜索，同时能够自信地进行识别肽，并不直接这样做。为了直接从真实的已知参考样品中提取样品到质谱，研究者构建了蓖麻毒素特异性质谱库，并证明了其在法医鉴定中鉴定蓖麻毒素肽的实用性。研究者为质谱库创建而开发的方法在具有广泛的应用。
主要使用方法：
作者使用了一组先前分析过的法证现实样品中的数据。这些样品是从蓖麻籽中提取的，方法不复杂（简单研磨，可能是浸泡并去除种皮，用有机溶剂去除蓖麻油和/或粗蛋白沉淀方法），可以在各种面向犯罪的互联网和印刷品中找到资料来源。然后，通过质谱分析了一系列蓖麻籽粗提物中的LC-MS / MS数据。使用两个蓖麻蛋白文库进行文库检索，并使用Sequest17和MSGF + 18-20通过标准数据库检索。文库搜索确定比蓖麻毒蛋白肽略多，多于蓖麻毒素肽标准数据库搜索。除了这两个蓖麻毒素谱库，还制造了一个蓖麻种子质谱库，使用相同的方法和来自部分蓖麻的LC-MS / MS数据种子提取物样品。在分析来自粗蓖麻籽提取物的LC-MS / MS数据时，使用该蓖麻籽质谱库导致了更多的质谱鉴定。
研究结果：
质谱库构建：
开发了一种定制的质谱选择工作流程。 此工作流程旨在通过选择最高质量的质谱图和最可靠的匹配项来最大化识别可信度。 为了测试工作流程中滤波步骤的效果和必要性，作者比较了四个版本的RKI谱库，这些版本使用了越来越严格的滤波器。库A使用了默认的库创建方法。 对于库B，添加了XREA过滤器，库的大小减少了十个质谱，蓖麻籽数据集搜索中匹配的平均质谱数稍微增加了每个数据集7％±7％SSM。下一个版本库C从MS-GF +，带有Percolator的Mascot，PeaksDB和带有Percolator的Sequest的数据库搜索结果开始，并使用共识PSM选择方法为该库选择质谱。 在蓖麻种子数据集搜索中，每个文件的SSM平均总数，平均每个文件平均增加35％±13％。 除此之外，与使用库A或B进行搜索相比，几种特定肽离子的点积得分也不断提高。研究者假设这是因为库A和B使用了BlibFilter40，它从给定的肽离子中选择所有其他质谱图上具有最高平均点积得分的质谱图。 在某些情况下，这会导致选择嘈杂的频谱，从而导致低点。库搜索结果中该肽离子的产品得分。 这种作用是肽依赖性的，对于某些蓖麻毒素肽而不是全部都发生。 共识的PSM选择方法克服了这个问题而是通过选择最可靠的质谱来代表文库中的肽离子，从而获得最大的分离度。应用于库D的未识别峰过滤器进一步减小了库的大小。 与库相比，每个文件搜索的SSM平均数量减少了12％±3％。 但是，高质量SSM的平均数量没有显着变化，这表明由于消除了不良的质谱，仅丢失了劣质SSM
该图显示了每个库搜索找到的SSM的点积得分的分布。图书馆D的搜索结果具有更少的SSM，并且在较高的点积得分下，它具有更多的SSM。 这在法医应用中是理想的方法。在法医应用中，特异性（低假阳性率）比灵敏度更重要。
质谱库搜索在52种蓖麻种子提取物中鉴定出的蓖麻毒素肽比数据库中搜索的蓖麻蛋白肽略多，无论使用哪种蓖麻毒素谱库。
与MS-GF +相比，使用SpectraST和Vec和RKI库发现的蓖麻蛋白SSM明显更多。
比较十四种未用于建立蓖麻文库的粗蓖麻籽提取物样品中所有蛋白（包括蓖麻蛋白和非蓖麻蛋白）的全部已鉴定质谱数。每个点代表一个样本，其x轴位置表示使用蓖麻籽质谱库通过SpectraST识别的SSM数量，其在y轴上的位置表示通过Sequest或MS-GF +通过数据库搜索识别的PSM数量。 与用MS-GF +和Sequest进行数据库搜索相比，蓖麻种子质谱库方法发现的蓖麻质谱要多得多。
主要讨论：
基础科学领域中蛋白质组学中的肽段鉴定通常通过数据库搜索完成，该数据库将观察到的质谱与从序列得出的理论质谱进行比较数据库。法医科学历来坚持将化合物鉴定与从标准获得的数据进行比较相联系，有时还包括经过认证或标准的参考材料。数据库搜索（与从肽序列数据库中获得的理论或预期质谱进行比较）构成了蛋白质组学的中坚力量，但在法医学领域却是一个陌生的范例。与真实标准进行某种形式的比较会有所帮助，并且可能会促进法医界采用蛋白质组学技术。但是，通过手动比较来鉴定肽的通量较低，并且可能会受到人为偏见的影响。一种更有效的替代方法是对从质谱仪产生的质谱进行自动比较。
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