最近学习了一下基因组的拼接原理，以下是我的学习笔记和一些思考。基因组的拼接原理是高通量测序技术的基础知识吧，我个人认为即使不做基 因组拼接工作，也可以学习一下几个主流拼接软件的算法和原理。我主要是学习了两个网上教程，其教程出处为https://github.com/ TGAC/361Division/tree/master/de_novo_2016和https://github.com/ lexnederbragt/INF-BIO9120_fall2013_de_novo_assembly/tree/master/presentations。
拼接是个啥？
A hierarchical data structure that maps the sequence data to a putative reconstruction of the target.(Miller et al 2010,Genomics 95(6):315-327) 基因组拼接可以类比成一本书被碎纸机碎个稀巴烂，然后用胶水把他们一片片给拼回去的过程。 
- 拼接的过程就像一个黑箱处理过程，reads序列输入，经过拼接黑盒，输出就是基因组拼接好的结果。正确的拼接应该是The right motifs,the correct number of times,in correct order and position。我个人认为是尽可能得还原真实的基因组是拼接的终极目的。
- 另外，拼接的算法分为试探型和穷举型两种，一般都用试探型算法，因为它更好更快更简单（在绝大多数时候）。穷举型算法局限性强、运行速度 慢、召回率低，并且数据类型不尽相同，因此没有很好的模型适合全部的数据类型。
- 在拼接之前，我们确保输入的数据是去除接头、污染等的good data，并且要大概知道拼接的原理。最后完成拼接后，要检查拼接结果的可靠性和完整性。
测序技术
测序长度越长，覆盖度越高，带来的拼接结果也会越好。并且根据研究目的的不同，我们使用不同测序技术，产生不同类型的数据，得到不同的测序 信息。 
拼接算法
None of which is assessed by length stats.
- Overlap Layout Consensus 找到重叠区域并且定义他们是key。layout有点难度。这种方法tracks每一条read。Consensus是由reads构建而成的。
- De Bruijn Graphs
- OLC VS DE bruijn
拼接实验前
- 有时候一次测序拼接结果可能很难达到预设的拼接目标，可能需要多次补测样品来完善拼接结果。我们在测序拼接前，需要知道所研究对象的基因 组的大小、倍型、杂合性、GC含量、是否有污染物/ 共生者、数据集的类型、是否线粒体还是叶绿体的细胞器基因组。其实这些内容在测序之前就需要考虑了，下面一些点进行进行较为详细的介绍 ：
（1）基因组大小的获取关系到对以后组装结果的大小的正确与否判断；基因组太大（>10Gb），可能会超出了目前denovo组装基因组软件的对机器存 的要求，从客观条件上讲是无法实现组装的。一般物种的基因组大小可以从公共数据库查到。如果没有搜录，需要考虑通过实验（流式细胞仪福尔根 染色/定量pcr/）或Kmer估计法来获得基因组大小。
（2）杂合度对基因组组装的影响主要体现在不能合并姊妹染色体，杂合度高的区域，会把两条姊妹染色单体都组装出来，从而造成组装的基因组偏 大于实际的基因组大小。一般是通过SSR在测序亲本的子代中检查SSR的多态性。杂合度如果高于0.5%，则认为组装有一定难度。杂合度高于1%则很难 组装出来。杂和度估计一般通过kmer分析来做，降低杂合度可以通过很多代近交来实现。杂合度高，并不是说组装不出来，而是说，装出来的序列不 适用于后续的生物学分析。比如拷贝数、基因完整结构。
（3）随着测序对质量要求越来越高和相关技术的逐渐成熟，遗传图谱也快成了denovo基因组的必须组成。
（4）实验设计需要考虑的问题：1.明确我们的生物学问题;2.设计数据处理方案；3.设置实验条件和生物/技术重复数；4.选择测序平台和覆盖度。
为啥拼接挺难的
- 重复序列
- 二倍体
- 多倍性
- 可供选择的软件多
两个拼接软件
- A modern assembler-SOAPdenovo2
- Trinity运行的原理和过程 1 Trinity 如何运作 a. 序列延伸 (inchworm) ——虫子 将 reads切为 k-mers (k bp长度的短片段) 拆分K-mer的目的：节省内存，降低测序错误对拼接的影响；利用Overlap关系对k-mers进行延伸 ( 贪婪算法)；输出所有的序列 (“ contigs”)。 b. 构建 de Bruijn graph (chrysalis)—— 成蛹 聚类所有相似区域大于1kbp的 contigs；构图 (区分不同的 “components”)； 将reads比对回 components，进行验证 c. 解图，列举转录本 (butterfly)——化蝶 拆分graph 为线性序列；使用reads以及 pairs关系消除错误序列。 2 组装质量评估与去冗余 d. 组装质量： 组装完整性、组装准确性、后续定量准确性、组装冗余度 N50长度，可以初步评估组装质量；但并非越长越好，应该参照相关的研究（同物种或近缘种）；通过统计Unigene对近缘种编码基因的覆盖度分， 也可以从整体评估组装质量。 3 注释与其他
组装评估
(1) kmer spectra，可用软件KAT、CEGMA； 
(2)使用生物学知识去进行评估验证
- Direct experimental evidence: the reads、Genome size、ploidy、GC content、Symbionts、Plastids、ESTs、cDNAs、peptides、genome walking
- Indirect experimental evidence: genomes in general（Genes! （They have structure，Repeats），Chromosome macrostructure ，(circular?, number, telomeres, …)）、other species（Close relatives: proteins, transcripts, genomes； Distant relatives: single-copy genes,?phylogeny, HGT）
误差和质控
样本的准备和建库：样品未纯化，PCR偏差（没有化学反应是perfect、complete的） 
N50并不是那么可靠、敏感，我们要注意。 
其他参考资料
https://www.cbcb.umd.edu/research/assembly_primer